色譜雙峰產(chǎn)生的原因及處理
液相色譜分析中,在色譜柱正常,樣品靈敏度足夠,分析方法合適,色譜峰在出峰時(shí)間較短的條件下(不包括梯度),峰型應對稱(chēng)而尖銳。但是,在對樣品了解程度不夠,方法不妥,樣品處理方法及進(jìn)樣方式不合理下,會(huì )出現各種意想不到的問(wèn)題,而對色譜峰難以作出合理的解釋。色譜雙峰指的是不是一種物質(zhì),但在色譜圖中出現雙峰,而表明含二種物質(zhì)??蓪⑦@種情況分為三種原因。
1 色譜柱
如果你分析樣品時(shí)發(fā)現每個(gè)色譜峰都雙峰出現(出峰越快,雙峰的可能性會(huì )減少),尤其采用單一純物質(zhì)時(shí),可以肯定色譜柱出問(wèn)題-柱頭受損或柱頭固定相變臟或流失。
如果進(jìn)樣量少,原來(lái)色譜柱正常,色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰,不一定拖尾,這一般應是柱頭受堵,將色譜柱反過(guò)來(lái)接,用流動(dòng)相沖洗或酸洗或其它溶劑,將堵在柱頭的殘留物沖掉,再反過(guò)來(lái),一般情況下就可以了。
當然不反沖,正沖有時(shí)也會(huì )正常的。如果峰拖尾,雙峰強弱相差不大,柱頭固定相變臟或流失可能性更大,這是可以將進(jìn)樣那頭擰開(kāi),將微孔濾片超聲,柱頭刮去一部分填料,重新填上新填料擰緊,不過(guò)這種活,需要一定技術(shù),否則用不了幾次,色譜柱就會(huì )應柱效很低而報廢。
2 溶劑極性及進(jìn)樣量
許多液相色譜分析者對此可能不以為然,一般的HPLC的書(shū)籍和文獻都不會(huì )提到這方面的內容,而這確是雙峰產(chǎn)生的一個(gè)很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜,流動(dòng)相多為甲醇、乙腈、水,加各種添加劑以改善分離性能。
樣品一般用與流動(dòng)相相溶的溶劑溶解。*的溶解方法是用流動(dòng)相溶解,但是很多情況是不一致的。
當用溶劑極性強度大的試劑,如純甲醇、純乙腈,純乙醇,而分析體系中以水為主,樣品進(jìn)樣量大,如定量管為20ul,此條件下*可以肯定,單一的純物質(zhì)出雙峰,第二峰比*峰?。看味疾惶粯樱?,且拖尾,保留時(shí)間會(huì )提前(相對進(jìn)樣量少而言),將進(jìn)樣量減少一半以上,峰型將變?yōu)檎?。這是樣品的溶劑與流動(dòng)相極性相差太大,而流動(dòng)相來(lái)不及將其稀釋達到平衡造成的。
上面提到進(jìn)樣量造成雙峰的一個(gè)原因,另一個(gè)原因是,進(jìn)樣量不一定大,但量很大,色譜圖上的雙峰緊靠在一起,基本上齊高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色譜柱問(wèn)題)。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了,這是由于進(jìn)樣量過(guò)大,色譜柱過(guò)載造成的。
3 樣品的特性
有些樣品由于其化學(xué)結構的特點(diǎn),存在互變異構現象,而這種互變異構體無(wú)法分開(kāi),而是以一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡存在。在色譜分析時(shí),在一個(gè)特定的條件下,一種物質(zhì)將出現雙峰,雙峰靠的很近,基本齊高,不拖尾,條件稍一變化,尤其pH,雙峰現象將消失,如紅霉素等。
有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰,但在LC-MS下,用質(zhì)譜檢測器,其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯。
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