HPLC中流動(dòng)相的配置的小妙招

樣品配置的小妙招：

 1.選用流動(dòng)相配置對色譜峰影響zui小

 2.流動(dòng)相溶解度達不到要求時(shí)，盡量選用流動(dòng)相中含有的比例較大的成分（有待考證），以減輕進(jìn)樣對流動(dòng)相的影響造成基線(xiàn)不穩。

 3.流動(dòng)相組成溶劑均達不到要求時(shí)，選取的溶劑應保證在設定波長(cháng)內無(wú)紫外吸收。

  流動(dòng)相的PH

      如需在一定PH值下操作，須定期測定流動(dòng)相的PH值，大氣中的CO2溶解在流動(dòng)相內將引起PH值的改變，特別是貯液瓶密閉不嚴時(shí)這種影響可能更大。

 更換柱子及流動(dòng)相

       軟質(zhì)或半軟質(zhì)填料的溶脹率隨溶劑極性的變化而變化，使用新柱時(shí)應先用25~30倍柱容積的合適流動(dòng)相平衡；更換流動(dòng)相時(shí)，如果兩種流動(dòng)相不互溶，需采用過(guò)渡溶劑使前一種流動(dòng)相逐步溶解除去，（例如，2、2、4-*基戊烷換成甲醇時(shí)，必須用乙酸已酯或其他溶劑過(guò)渡，直到標準物保留值達到穩定狀態(tài)）。

HPLC中流動(dòng)相的配置必須注意以下幾點(diǎn)：

 流動(dòng)相的選擇

 流動(dòng)相的混合

    雙泵主要是在探討流動(dòng)相的配比或者梯度洗脫是比較方便，知道確切的液相條件時(shí)，建議配好后使用的話(huà)，混合比較均勻，效果較好。

脫氣

 HPLC所用流動(dòng)相必須預先脫氣，否則容易在系統內逸出氣泡，影響泵的工作。

 系統中氣泡的產(chǎn)生：流動(dòng)相本身存在，梯度淋洗混合后放出氣泡；

 氣泡的影響：存在于管路中，系統壓力不穩定，實(shí)驗結果有偏差；

 存在于單向閥中，易造成液體回流，流量不準確，甚至是不吸液；

 存在于檢測器中，出現鬼峰，影響檢測準確性。

        所以做液相對流動(dòng)相的氣泡和雜質(zhì)要求比較嚴格。氣泡會(huì )影響柱的分離效率，檢測器的靈敏度、基線(xiàn)穩定性，甚至使無(wú)法檢測。（噪聲增大，基線(xiàn)不穩，突然跳動(dòng)）。此外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會(huì )引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來(lái)誤差?！　?/span>

      溶解氧能與某些溶劑（如，甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡(luò )合物，此絡(luò )合物會(huì )提高背景吸收（特別是在260nm以下），并導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會(huì )在梯度淋洗時(shí)造成基線(xiàn)漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會(huì )引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學(xué)檢測中（特別是還原電化學(xué)法），氧的影響更大。除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。

       常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。

 1.氦氣脫氣：氦氣脫氣是很有效的脫氣方法。氦氣緩緩的通過(guò)流動(dòng)相趕去溶入的空氣，如果使用得當，在10min內可除去80%～90%的溶入氣體。由于氦氣在流動(dòng)相中的溶解度極低，所以用氦氣脫氣保護的流動(dòng)相可以認為是一個(gè)無(wú)氣體溶解體系。其缺點(diǎn)是氦氣價(jià)格比較昂貴，會(huì )增加檢驗成本。一般說(shuō)來(lái)有機溶劑中的氣體易脫除，而水溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相當有效的脫氣方法，這種連續脫氣法在電化學(xué)檢測時(shí)經(jīng)常使用。但氦氣昂貴，難于普及。

 2.真空脫氣：也是比較常用的脫氣方法?，F在多數企業(yè)都zui常用這種辦法，貯液器被抽成部分真空，溶入的氣體蒸發(fā)形成氣泡溢出，其效果僅次于氦氣脫氣。象Agileng1200液相色譜使用的是在線(xiàn)脫氣機。在線(xiàn)脫氣只適合脫完氣之后的流動(dòng)相，在使用過(guò)程中的微量脫氣。

 3.超聲波脫氣：將配制好的流動(dòng)相連容器放入超聲水槽中脫氣10～20min。這種方法比較簡(jiǎn)便，又基本上能滿(mǎn)足日常分析操作的要求，所以，目前仍廣泛采用。這種方法只能除去30%的溶解氣體，有時(shí)還會(huì )引起氣體溶解度的增加。對氧敏感的檢測器不宜用此法。

 4.加熱回流脫氣：該方法雖然效果很好，但是適用范圍較窄。對于有機溶劑或混合流動(dòng)相不適合用此法，因為揮發(fā)性組分會(huì )損失掉，改變流動(dòng)相的組成。

      綜合來(lái)說(shuō)，用真空抽濾后，再用超聲脫氣還是zui常用的辦法，用氦氣的方法是效果的辦法，而在線(xiàn)脫氣本身也是真空脫氣，但它可以放到儀器上使用，是一種保證性的辦法。

 A.離線(xiàn)（系統外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，氣體立即開(kāi)始回到溶劑中。在1~4小時(shí)內，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽和。

 B.在線(xiàn)（系統內）脫氣法無(wú)此缺點(diǎn)。zui常用的在線(xiàn)脫氣法為鼓泡，即在色譜操作前和進(jìn)行時(shí)，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴格來(lái)說(shuō)，此方法不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氦）將空氣替換出來(lái)。此外還有在線(xiàn)脫氣機?！?/span>