制備型液相色譜的分類(lèi)

制備型加壓液相色譜，按照色譜柱和樣品量的大小，分為：

（1）低壓液相色譜；

（2）中壓液相色譜；

（3）高壓液相色譜；

（4）快速色譜。

低壓、中壓與高壓液相色譜的壓力范圍之間會(huì )存在一定交疊，沒(méi)有統一、明確的標準。

快速色譜

      柱壓通常為2bar（或30psi）左右，對于那些容易分離的簡(jiǎn)單混合物，由于快速色譜具有操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟等優(yōu)點(diǎn)，常常是實(shí)驗室的。但快速色譜不同于一般的層析分離，這種分離沒(méi)有壓力，而快速分離通常使用瓶裝氮氣加壓，使流動(dòng)相具有一定的流速，從而縮短了分離時(shí)間。Still等人于1978年詳細研究了快速色譜，并于1981年獲得了保護(美國4，293，422)?？焖偕V使用的柱子一般是玻璃柱，柱直徑為3～10cm．長(cháng)度為7～15cm?？焖偕V中使用zui廣泛的固定相為硅膠。采用的粒徑通常為：25～40μm，40～63μm或63～200μm的球形固定相。其它如鍵合相、氧化鋁、聚酰胺吸附劑也常用作快速色譜的固定相使用。

低壓色譜（LPLC）

      柱壓一般低于5bar（或75psi）。低壓色譜一般是由蠕動(dòng)泵、進(jìn)樣閥和檢測器組成，可以連續化，實(shí)現自動(dòng)的梯度淋洗和餾分收集等操作。色譜柱管一般是玻璃或聚合物材料的，長(cháng)度一般為240-440mm，內徑為10-40mm。對于大多數在紫外區有吸收的物質(zhì)，光學(xué)檢測器很常用。填料一般使用軟質(zhì)的葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、合成高聚物或離子交換劑，粒徑一般為40-60μm。

中壓液相色譜（MPLC）

       柱壓在5-20bar（或75-300psi）之間，廣泛用于實(shí)驗室和工業(yè)規模的生物制品(如動(dòng)物臟器提取液、濃縮液、體液、植物提取液、生物技術(shù)發(fā)酵液等--往往需要經(jīng)過(guò)濾膜作初級凈化)的處理，以提取或純化所需的產(chǎn)品。中壓液相制備色譜的主要部件為輸液泵、進(jìn)樣閥、檢測器、餾分收集器等，比如瑞士公司的早期的中壓液相制備色譜，其輸液泵zui大流速可達156mL/min，并配有阻尼器，以保證液流的穩定；進(jìn)樣器配有0.5-50mL的不同體積的定量管；檢測器有紫外和示差折光檢測器，流通池體積比較大，允許大流量流動(dòng)相通過(guò)而無(wú)需分流；餾分收集器有原盤(pán)式和排式兩種，原盤(pán)式的接收管zui多達80個(gè)，而后者則更多；色譜柱內徑9-105mm，長(cháng)度250-1760mm不等。對于一般中壓制備色譜，當色譜柱直徑較大時(shí)，柱頭往往設計成錐形或有類(lèi)似于傘狀的液流導向結構，使得當大量樣品進(jìn)入到柱頭上時(shí)，能迅速地分散到整個(gè)柱橫截面上，及時(shí)被流動(dòng)相沖走，避免了因樣品的局部過(guò)濃而引起柱超負荷和譜帶加寬。柱子填料則采用比較耐壓的交聯(lián)改性的多糖凝膠(如Sepharose CL，Superose等)，聚合物微球，復合材料介質(zhì)或硬質(zhì)SiO2基體的化學(xué)鍵合相等，粒徑一般在25～40μm（zui常用的填料尺寸是15-25μm，25-40μm或40-63μm），可采用濕法或干法裝柱。

高壓液相色譜(HPLC)

      是指柱壓一般大于20bar（或300psi）的“高壓(或)液相色譜”，通常指所用色譜柱的塔板數大于2000，一般是在2，000～20，000的范圍之間。當需要從大量的物質(zhì)中分離純化不足1％的所需成分時(shí)，分離工作將會(huì )十分困難，往往在純化的zui后階段需要使用10μm或更小顆粒的填料。為獲得所需微量組分，可采用如下分離手段：制備型分離→半制備型分離→分析型分離→產(chǎn)物。為提高每次分離獲得純品的數量，制備型高壓液相色譜分離通常在超載情況下運行。高壓液相色譜，即目前常用的液相色譜。色譜柱內填裝的是粒度范圍較窄的微小顆粒固定相(3～30μm)，為使流動(dòng)相流出，需采用較高的壓力，同時(shí)系統的復雜性及成本亦增大，但分辨率可得到較大的提高。而填裝較大顆粒的固定相時(shí)，如中壓液相色譜系統，裝柱較容易，柱的通透性較高(只需較低的泵壓力)，可采用更大的色譜柱和更經(jīng)濟的儀器，由此分辨率也較低。

用分析型高壓液相色譜進(jìn)行制備型分離

    當所需純化合物的量很少時(shí)(微克級至幾毫克)，可用分析型色譜柱進(jìn)行多次分離。效果和利用大直徑色譜柱進(jìn)行一次性分離相同。采用小直徑色譜柱時(shí)，可利用已有的分析型儀器，而無(wú)需在色譜柱、填料及附件方面投入更大資金；另外，還可在很大程度上避免由于放大所產(chǎn)生的問(wèn)題，使分離速度加快。小直徑色譜柱的尺寸一般為250×4.6mm，通常裝有反相填料，每次可進(jìn)樣5～100ug，通過(guò)多次進(jìn)樣分離，可獲得足夠的純品。例如，Suzuki等(1994)報道從豆科植物羽扇豆(Lupinus Hirsutus)中分離一羽扇豆生物堿糖苷時(shí)，其zui后的分離步驟采用LiChrosorb Si60，5μm，250×4.6mm色譜柱進(jìn)行高壓液相色譜分離，洗脫劑為含25％甲醇的yi醚溶液－5％氨水50:1。經(jīng)常需用分析型色譜柱進(jìn)行分離的一個(gè)領(lǐng)域是對肽類(lèi)化合物的純化。生物活性肽的含量通常很低，用分析型高壓液相色譜作為zui后的純化手段時(shí)，不會(huì )使色譜柱超載。為了提高分離效率，可將分析型高壓液相色譜柱連接起來(lái)使用。此時(shí)可采用顆粒度在20～30μm的填料，以保持適當的通透性，尤其是當使用含水溶劑時(shí)。當使用己烷等有機溶劑時(shí)，由于流動(dòng)相的粘度較低，可使用顆粒度為10μm的填料。然而由于分析型色譜系統無(wú)法提供大規模制備型分離所需的流速，其應用受到一定限制。                         

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